Elektroforetik hareketlilik kayma yöntemi ile transkripsiyon faktör-promotör etkileşiminin belirlenmesi

Abstract

DNA'da var olan bilginin kullanımı ve düzenlenmesi proteinler ile ilişki içerisindedir. DNA'ya bağlanan proteinler organizmada transkripsiyon, paketlenme, DNA tıpkı yapım (replikasyon) ve DNA onarımı gibi süreçlerin her basamağında önemli role sahiptir. Protein-DNA arasında kurulan bağın doğasını anlamak, genetik işleyişi çözmek açısından büyük öneme sahiptir. DNA-protein etkileşiminin tanımlanmasında DNaseI footprinting, nitroselüloz filtreleme, ChIP yöntemleri uygulanmaktadır. Elektroforetik hareketlilik kayma yöntemi (Electrophoretic mobility shift assay/EMSA) protein-nükleik asit etkileşimlerinin belirlenmesinde kullanılan hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. EMSA radyoaktif temelli bir yöntem olmakla birlikte, radyoaktif olmayan işaretleme yöntemleriyle de kullanılabilmektedir. Tez çalışmasında, DNA-protein ilişkisinin tanımlanmasında sıklıkla kullanılan bir yöntem olan EMSA'yı laboratuvar koşullarımızda radyoaktif olmayan işaretleme ile optimize etmeyi amaçladık. Wnt5b, Fzd4, Fzd5 ve Fzd7 genleri çalışmamızda model olarak kullanıldı. Bu genlere ait promotör bölgelerine bağlanan transkripsiyon faktörleri biyoinformatik yöntemlerle belirlendi. Dört gene de, ortak bağlandığı hipopetik olarak gösterilen üç transkripsiyon faktörü ile çalışıldı. Bunlar; ?genomatix genom çözümleme yazılımı? kullanılarak belirlenen Sp1, Egr-1, KLFS transkripsiyon faktörleridir. Yapılan çalışmalar sonrasında radyoaktif olmayan EMSA yöntemi, laboratuvar koşullarında optimize edilmiştir. EMSA'nın ileriki çalışmalar için bir araç olarak kullanılması planlanmaktadır The organization and use of information on the DNA molecules is closely related with protein binding. DNA binding proteins have important roles in all steps of DNA packaging, transcription, replication and repair. Understanding the nature of DNA-protein interactions are important for analyzing genetic processes. DNaseI foot printing, nitrocellulose filter binding and ChIP methods are used for direct detection of DNA-protein interactions. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is a fast and sensitive method for determination of nucleic acids-DNA interactions. Although EMSA is a radioactive method, it can also be used with non-radioactive labeling. In our work, we tried to optimize a non-radioactive based EMSA method in our laboratory. Wnt5b, Fzd4, Fzd5 and Fzd7 gene promoters were used in our work. The transcription factors which bind to promoter regions of these genes were determined with bioinformatics methods. We worked with three transcription factors which bind to all of the four gene promoters. These are the Sp1, Egr-1 and KLF transcription factors which were determined by Genomatics genome analyzing software. We optimized the non-radioactive EMSA method for our laboratory and we plan to use this method for our future projects to explore DNA-Protein interactions.