Wnt gen ekspresyon düzeyinin apoptotik uyarı verilmiş hücrelerde araştırılması

Abstract

Birçok çalışma Wnt sinyal yolağının programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) çeşitli mekanizmalar üzerinden regüle ettiğini göstermektedir. Apoptotik uyarı verilmiş bazı hücre hatlarında `PCR Array' yöntemi ile yapılan çalışmalarda Wnt sinyal yolağında yer alan birçok genin ekspresyon düzeylerinde değişiklikler gözlenmiştir (yayınlanmamış veri). Bu çalışmalardan yola çıkılarak, Wnt1,Wnt4,Wnt5a,Wnt7a,Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a genleri tez çalışmamız için seçildi. Bu genlerin apoptotik uyarı altında ki ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi hedeflendi. Bu amaçla, ekspresyon seviyesindeki değişikliklerin belirlenmesinde, İkili Lusiferaz Bildirici Deneyi (Dual Luciferase Reporter Assay), hücrelerin apoptotik süreçlerinin incelenmesinde (apoptotik uyarının ölçülmesinde) ise Kaspaz 3 aktivitesi ölçümü kullanıldı. Seçilen genlerden sadece Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a promotör dizileri bildirici vektörlere klonlandı. Bu vektörler Kelly hücre hattına transfekte edildi ve transfekte hücrelerde apoptoz tetiklendi. Apoptotik uyarının ardından bildirici vektörlerin lüsiferaz ölçümleri yapılarak veriler toplandı. Yapılan deneylerde, apoptozun tetiklendiği transfekte hücrelerde Wnt7b, Wnt8a ve Wnt10a genlerinin promotörlerinde normale göre 1,5 katlık bir artış izlendi. There are many studies reporting that Wnt signaling pathways regulate programmed cell death through different molecular mechanisms. In one of our previous studies we observed striking differences in genes of the Wnt signaling pathway by using a PCR array methodology (unpublished data). Based on these data we chose to study differences in the levels of Wnt1,Wnt4,Wnt5a,Wnt7a,Wnt7b, Wnt8a and Wnt10a genes after before and after apoptotic stimuli. A dual luciferase reporter assay was used to evaluate gene expression and caspase 3 activation was used for the evaluation of apoptosis. Only Wnt7b, Wnt8a and Wnt10a promoters were cloned in to reporter vectors. These vectors were transfected in to Kelly cells which were subsequently induced to undergo apoptosis Luciferase measurements of each promoter were evaluated. An 1.5 fold increase in activity was observed for the Wnt7b, Wnt8a and Wnt10a gene promoters after apoptotic induction.