Kolon ve rektum kanserlerinde endostatinin matriks metalloproteinaz -2 üzerine gösterdiği etkinin araştırılması

Abstract

Giriş: Kolorektal kanser, görülme sıklığı en yüksek olan kanserler arasındadır. Anjiogeneze bağımlı olan tümör metastazı ve progresyonuæ bazal membran (BM) ve ekstrasellüler matriksin (ESM) degradasyonu, hücre adezyonunun değişmesi ve tümör hücresinin fiziksel hareketliliğini kapsar. Tüm bu aşamalar içindeæ aşırı ESM yıkımı tümör metastaz ve progresyonunda önemli rollere sahiptir. ECM'in degradasyonunda birçok proteinaz sistemleri rol oynamakla birlikte matriks metalloproteinazlar (MMP) bunların başında yer alır. Yapılan deneysel kanser modellerinde ve hasta çalışmalarında MMP-2 ve MMP-9'un kolorektal kanser progresyonu, invazyonu ve metastazında rolleri olduğu bildirilmektedir. Bu enzimlerin aktiviteleri ekstrasellüler olarak regüle edilir ve regülasyonları pro-enzim aktivasyonu ile doku inhibitör proteinleri olan TIMP'ler arasındaki dengeye bağlıdır. Bundan başka MMP-2 ve MMP-9'un VEGF gibi proanjiogenik ve endostatin gibi antianjiogenik moleküllerin oluşumunda da rol aldığı bildirilmektedir. Bu nedenle bu enzim sisteminin aktivasyonu tümör progresyonunda farklı aşamalarda büyük önem taşımaktadır. Amaç: Kolon ve rektum kanserlerinin gelişim mekanizmalarına ilişkin literatür incelediğinde bu mekanizmaların birbirinden farklı olduğunu bildiren çalışmalar ve bunların total kolorektal olarak değil homojen ayrı iki tip tümör grubu olarak çalışılmasını savunan görüşler vardır. Biz de bu görüşü savunarak, gerçekleştirdiğimiz bu çalışmada kolorektal kanserleri kolon ve rektum tümörü olarak homojen ayrı iki grup olarak değerlendirdik. Bu araştırmanın temel amacı jelatinaz aktivasyon düzeylerini, MMP-2'nin endojen inhibitör proteini TIMP-2, aktivatör proteini MT-1 MMP ve anjiogenez regülasyonunda rol oynayan anjiogenik potansiyeli yüksek olan VEGF ve anjiogenez inhibitörü endostatinin protein düzeylerini her iki tip tümör ve eşlenik normal dokularda ayrı ayrı araştırmak ve bu parametrelerin klinikopatolojik değişkenler ile ilişkisini tanımlamaktır. Ayrıca in vitro koşullarda HT-29 kolon adenokarsinoma hücre dizinde rekombinant endostatinin hücre canlılığı, invazyonu, MMP sekresyonu ve aktivitesi üzerine etkilerini araştırmaktır. Materyal ve Yöntem: Çalışma 50 kolon ve 34 rektum tümörlü hastadan alınan tümör ve eşlenik normal dokularda gerçekleştirildi. MMP-2, MMP-9 aktivasyon düzeyleri jelatin zimografi ile incelenmiştir. MT-1 MMP aktivite düzeyleri enzim aktivite ölçüm yöntemi ile analizlenmiştir. TIMP-2, VEGF ve endostatin protein düzeyleri ise ELISA ile belirlenmiştir. Ayrıca tümör ve eşlenik normal dokulardaki endostatin ekspresyonu Western Blot yöntemi ile araştırılmıştır. İn vitro deneylerde HT-29 hücrelerinin canlılığı MTT testi ile değerlendirildi. Hücrelerin invazyon yetenekleri, matrijel ile kaplanmış 8 mm büyüklüğünde por içeren hücre plaklarında değerlendirilmiştir. Bulgular: Kolon tümör dokusunda MMP-2'nin pro ve aktif, MMP-9'un ise aktif formları eşlenik normal dokuya göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p 0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler incelendiğinde tümör dokusu aktif MMP-9 ile tümör invazyon derinliği pT1 vs pT3-4 (p=0.011) ve uzak metastaz varlığı arasında anlamlı ilişki saptandı. Rektum tümör dokusunda ise MMP-2 ve MMP-9'un hem pro hem de aktif formlarının aktivite düzeyleri, eşlenik normal doku aktivite düzeylerine göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu (p 0.05). Parametreler ile klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişki incelendiğinde ise rektum tümör aktif MMP-9 ve aktif MMP-2/ProMMP-2 (rMMP-2) ile tanı anı metastaz arasında (sırasıylaæ p=0.002 ve p=0.006)æ ve tümör aktif MMP-9 ile perinöral invazyon varlığı arasında (p=0.042)æ tümör proMMP-9 ve proMMP-2 ile lenf nodu metastazı (sırasıylaæ p= 0.012, p=0.021)æ tümör TIMP-2 düzeyleri ile nüks arasında (p=0.011) ve tümör VEGF düzeyleri ile perinöral invazyon arasında anlamlı ilişki saptandı (p=0.044). Ayrıca rektum tümör çapı ile VEGF düzeyleri arasında anlamlı orta derecede pozitif korelasyon belirlendi (p=0.009 r=0.454). İn vitro deneyler ile rekombinant endostatinin HT-29 hücre dizinde hücre canlılığını ve proMMP-2 aktivite düzeylerini anlamlı olarak azalttığı saptandı (p Sonuç: Kolon tümörlerinde aktif MMP-9 ile tümör invazyon derinliği "pT1 vs pT3-4" ve uzak metastaz varlığı arasında saptanan anlamlı ilişki, kolon kanserinin agresif kliniğinde önemli rol oynayabilir. Rektum tümörlerinde MMP-2 ve MMP-9 aktivite seviyeleri, TIMP-2, VEGF seviyeleri ile tanı anı metastaz, perinöral invazyon, lenf nodu metastazı ve nüks arasında saptanan anlamlı ilişkilerin rektal kanser pronozuna yönelik ileri çalışmalar için katkısı olabileceğini düşünmekteyiz. Rekombinant endostatinin HT-29 hücrelerinde hücre canlılığı ve MMP-2 sekresyonuna yönelik bulgularımızın da kolon kanserinde antikanser stratejilerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar için yararlı olacağını düşünmekteyiz. Background Colorectal cancer, one of the most prevalent cancers worldwide, is the second leading cause of cancer-related mortality in developed countries. Tumor metastasis and progression, which depend on angiogenic process, include the proteolytic degradation of the basement membrane (BM), and the extracellular matrix (ECM), altered cell adhesion and the physical movement of tumor cells. Among these steps, excessive degradation of the matrix is one of the hallmarks of this process. Many proteinases are capable of degrading ECM components, but the proteinase system primarily responsible for ECM degradation is matrix metalloproteinase (MMPs). MMP-2 and MMP-9 have been implicated to play a role in colorectal cancer progression, invasion and metastasis in animal models and patients. The enzyme activity is regulated extracellularly and its regulation is mainly based on the balance between pro-enzyme activation and inhibition by tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). Furthermore previous studies have shown that MMP-2 and MMP-9 may directly regulate angiogenesis by generating pro-angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF), as well as the anti-angiogenic factor endostatin. Hence the regulation of the activity of these proteinases appears to be of great importance in tumor progression at different stages. Aim Since observations support the theory that development of colon and rectal cancers may involve different mechanisms, we classified colorectal cancer into colon and rectal cancer. We focused on the activity level of MMP-2, MMP-9, TIMP-2, MT-1 MMP, VEGF and endostatin protein level between tumor areas compared with normal tissue specimens and investigated potential relationships between these parameters and clinicopathological variables in colon and rectal cancers. With in vitro experiments, we also examined how these MMP-2 secretion and activity may be regulated by recombinant endostatin and we also determined the possible role of endostatin on cell viability and invasion of human colorectal adenocarcinoma cell line, HT-29. Methods Tumor and normal tissue specimens were obtained from colon (n=50) and rectal carcinoma (n=34). MMP-2 and MMP-9 activity levels were examined using gelatin zymography. MT-1 MMP activity level was analysed by activity assay. TIMP-2, VEGF and endostatin protein levels were examined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Also the protein expression level of endostatin was assessed by Western Blotting. The in vitro invasion assay was carried out using Transwell chamber with 8 mm diameter polycarbonate membrane precoated with Matrigel. Results In colon tumors activity levels of pro and active MMP-2 and also active MMP-9 were significantly higher than in the corresponding normal tissue (p Conclusion The significant relationships between the increased activity of MMP-9 and tumor invasion depth "pT1-2 vs pT3-4"and distant metastases reflect that MMP-9 may play a role in predicting the agressive behavior of colon cancer. In addition, a number of significant relationships demonstrated between MMP-2, MMP-9 activity level, TIMP-2, VEGF levels and tumor pathology including metastatic disease during the diagnosis, perineural invasion, lymph node metastasis, recurrence might contribute to further investigation of possible prognostic significance in rectal cancer. Also the results of the cell culture experiments on the effect of recombinant endostatin on cell viability and MMP secretion of the HT-29 are expected to contribute to further investigation for anticancer strategies in colon cancer.