İshalli dışkılarda Microsporidium spp. ve Cryptosporidium spp.'nin saptanması,PCR yöntemi ile tür tayininin yapılması

Abstract

Amaç: Ülkemizde boyama yöntemi ile tespiti henüz standardize edilememiş olan Microsporidium spp.'nin Weber'in trichrome boyama yöntemi ile saptanması, ishalli dışkılarda Microsporidium spp. ve Cryptosporidium spp.'nin tanısında mikroskobi ve PCR yöntemlerinin karşılaştırılması ve her iki parazitin tür ayrımının yapılmasını hedefledik. Gereç-Yöntem: Ekim 2005- Ocak 2009 tarihleri arasında, Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin çeşitli kliniklerine başvuran ve İzmir'in Buca ilçesine ait bir köyde saptanan ishal salgınından elde edilen 162 ishalli dışkı örneği çalışma kapsamına alındı. Tüm örnekler Cryptosporidium spp.'nin saptanması için Kinyoun acid fast ve Microsporidium spp.'nin saptanması için Weber'in trichrome boya yöntemleri ile mikroskobik olarak değerlendirildi. Ayrıca PCR yönteminin geçerliliğinin belirlenebilmesi için her iki parazite bu yöntem uygulandı. Bir sonraki aşamada Cryptosporidium ve Microspordium spp'nin tür ayrımlarının yapılabilmesi için RFLP yöntemi uygulandı. Bulgular: Kinyoun acid fast boya yöntemi ile 18 olgunun dışkı örneğinde Cryptosporidium spp. ookistleri saptandı. PCR yöntemi ile bu 18 olgudan 15'inde ve boya yöntemi ile negatif olarak değerlendirilen 6 olguda Cryptosporidium spp.'ye özgü bant saptandı. PCR ile parazit saptanan olgulara RFLP yöntemi uygulandı. Olgulardan birinde Cryptosporidium meleagridis'e, 20 olgunun dışkı örneğinde ise Cryptosporidium parvum'a özgü bantlar saptandı. Weber'in trichrome boya yöntemi ile 4 olgunun dışkı örneğinde Microsporidium spp. sporları saptandı. PCR yöntemi ile bu olgulardan sadece birinde Microsporidium spp.'ye özgü bantlar saptandı. PCR amplifikasyonunda tüm türlere yönelik primerler olan "panmicrosporidian primerler" kullanılarak tür ayrımı yapıldı. PCR ile parazit saptanan olgunun dışkı örneğinde Encephalitozoon intestinalis'e özgü bantlar saptandı. Sonuç: Cryptosporidium spp.'nin tanısında PCR yönteminin önemli bir yeri olduğuna, özellikle parazitin yoğun olduğu dışkılarda paraziti saptama gücünün yüksek olduğuna karar verildi. Microsporidium spp.'nin saptanmasında ise boya yönteminin tanıda geçerliliğini koruduğu, uygun DNA ekstraksiyon prosedürünün oluşturulmasına yönelik moleküler çalışmaların yapılması gerektiği düşünüldü. Anahtar kelimeler: Cryptosporidium spp., Microsporidium spp., Kinyoun acid fast, Weber'in trichrome boyası, PCR-RFLP. Aim: Our objective was to use Weber's trichrome staining method in detection of Microsporidium spp. of which convenient staining method for diagnosis yet to be standardized in our country, and to compare effectiveness of microscopy and PCR methods in detection of Microsporidium spp. and Cryptosporidium spp. in diarrheic stool samples and species identification of both parasites. Materials and Methods: Stool samples of 162 diarrheic patients who attended to various clinics of Hospital of Faculty of Medicine, University of Dokuz Eylul between October 2005 and January 2009 and of patients in an outbreak of diarrhea which took place in a village in Buca district of İzmir, were included in our study. All samples were stained by Kinyoun acid-fast method to search Cryptosporidium spp. and by Weber's trichrome staining method to search Microsporidium spp. and were examined by microscopy. Additionally, PCR was used for both parasites to test its validity as a diagnostic tool. In succeeding step, RFLP was used in species identification of both, Cryptosporidium spp. and Microspordium spp. Results: Oocysts of Cryptosporidium spp. were detected in 18 cases by Kinyoun acid fast staining method. PCR revealed Cryptosporidium spp. spesific bands in 15 of 18 patients who were staining positive and 6 of staining negative patients. RFLP method was applied to PCR positive stool samples and one sample had Cryptosporidium meleagridis spesific band while remaining 20 samples had Cryptosporidium parvum spesific bands. We observed spores of Microsporidium spp. in stool samples of 4 cases stained by Weber's trichrome method and only one of them was positive in PCR. Panmicrosporidian primers were used in amplification and PCR positive patient revealed Encephalitozoon intestinalis spesific bands. Conclusion: PCR is an important diagnotic tool in diagnosis of Cryptosporidium spp., especially in cases with high parasite density. In diagnosing Microsporidium spp., staining procedure sustains its validity and more molecular studies are needed to supply convenient DNA extraction procedure. Keywords: Cryptosporidium spp., Microsporidium spp., Kinyoun acid fast, Weber's trichrome, PCR-RFLP.