Resveratrol'ün hipoksi-reoksijenasyon ile indüklenen ın vıtro endotel hücresi hasarına etkisinin ve nrf2'nin olası rolünün araştırılması

Abstract

Giriş ve amaç: Merkezi sinir sisteminin iskemik hastalıklarında parankimde olduğu gibiendotel hücresinde de çok sayıda biyokimyasal ve fonksiyonel değişiklikler ortaya çıkar. Buaraştırmanın temel amacı, resveratrolün insan serebral mikrovasküler endotel (HCMVE)hücrelerini in vitro ortamda oksidatif hasara karşı koruyup korumadığını incelemek veresveratrol endotel hücrelerini koruyorsa, bu etkinin Nrf2 (Nuclear transcription factorerythroid 2p45-related factor 2) yolu ile mi olduğunu araştırmaktır. Araştırmada denenen vekullanılan iskemi reperfüzyonun in vitro modeli, oksijen glukoz deprivasyonu vereoksijenasyon + ortama glukoz eklenmesi (OGD + RGE) uygulamasıdır.Gereç ve yöntem: HCMVE hücrelerine OGD (6 saat) + RGE (15, 60 dakika ve 24 saat)uygulaması yapıldı ve bu süreler sonunda reaktif oksijen türleri APF (3'- (p-aminofenil)floresin) ve HPF (3'- (p-hidroksifenil) floresin) floresan probları ile değerlendirildi.Resveratrolün reaktif oksijen türleri oluşumu üzerine etkilerini araştırmak üzere hücrelerefarklı dozlarda resveratrol (0.1, 1, 10, 50 ve 100 M) ile 1 saat pre-inkubasyon uygulandı.Resveratrolün Nrf2 aktivasyonu üzerine olan etkisini değerlendirmek için hücreler 10 Mresveratrol ile 1, 3, 6, 9 ve 24 saat sürelerle inkube edildi.Bulgular: HCMVE hücrelerinde 6 saat OGD uygulamasını izleyen RGE'nin 60. dakikasındaAPF ve HPF problarıyla ayrı ayrı ölçümlenen reaktif oksijen türlerinin anlamlı olarak arttığıgözlendi (sırasıyla p değerleri: 0.004 ve 0.016). Resverarolün kullanılan tüm dozlarının 6 saatOGD uygulamasını izleyen RGE'nin 60. dakikasında reaktif oksijen türleri üretimini anlamlıolarak azalttığı saptandı (p: 0.004). Ayrıca, resveratrolün HCMVE hücrelerinde birinci saattesitoplazmada Nrf2 ekspresyonunu artırdığı, 3. saatten itibaren bandın azalarak 9. saattenitibaren kaybolduğu saptandı. Sonuçlar: Bu çalışmada OGD + RGE uygulanan HCMVE hücrelerinde resveratrolün,incelenen koşullarda, reaktif oksijen türleri oluşumunu azalttığı saptanmıştır. Ayrıca,resveratrolün HCMVE hücrelerinde Nrf2 protein ekspresyonunu da, incelenen koşullardaartırdığı, literatürde ilk kez gösterilmiştir. Introduction and aim of study: The ischemic diseases of the central nervous system witnessseveral biochemical and functional changes in the endothelial cells as well as in theparenchyma. The aim of this investigation is to investigate whether resveratrol protects humancerebral microvascular endothelial cells (HCMVE) against oxidative injury exerted by an invitro model of ischemia-reperfusion: "oxygen- glucose deprivation (OGD) and reoxygenation+ glucose supplementation (RGS)" and in case of positivity, to study further if this effect ismediated by Nrf2 (Nuclear transcription factor erythroid 2p45-related factor 2)Materials and methods: HCMVE cells were submitted to OGD (6 hours) + RGS (15, 60 minand 24 hr) and at the end of the incubation periods, the reactive oxygen species were assessedusing the fluorescent probes, APF (3'- (p-aminophenyl) florescein) and HPF (3'- (phydroxyphenyl)florescein). The effects of resveratrol on the formation of reactive oxygenspecies were investigated by pre-incubation for one hour with different doses of resveratrol(0.1, 1, 10, 50 ve 100 M). In order to assess the effect of resveratrol on Nrf2 activation, cellswere incubated for different periods ( 1, 3, 6, 9, and 24 hours) with 10 M resveratrol.Results: The analysis with APF and HPF probes showed statistically significant increases inthe 60-min RGE (p= 0.004 and 0.016, respectively), following the 6-hour OGD application tothe HCMVE cells. At the 60th minute of RGS following 6-hour OGD, resveratrol significantlydecreased (p: 0.004), the production or reactive oxygen species, at all doses applied. Inaddition, resveratrol increased, at 60 minutes, the Nrf2 expression- the Nrf2 band attenuatedstarting with the 3rd hour, while completely disappearing at the 9th hour. Conclusions: This study showed that resveratrol decreases the production of reactive oxygenspecies in the HCMVE cells submitted to OGD + RGS, under the condition studied. Inaddition, it has been shown for the first time that resveratrol increases the expression of Nrf2protein, in the HCMVE cells, under these conditions.