Staphylococcus aureus suşlarında panton valentin lökosidin (PVL) varlığının polimeraz zincir tepkimesi ile araştırılması

Abstract

Staphylococcus aureus, virulans faktörlerine bağlı olarak insanda deri infeksiyonlarından septisemiye kadar değişen pek çok infeksiyona yol açabililen bir patojendir. S. aureus'un virulans faktörlerinden Panton-Valentin lökosidin (PVL), doku nekrozuna yol açan bir sitotoksindir. PVL aynı zamanda son yıllarda çeşitli ülkelerde ortaya çıkan toplum kökenli MRSA (metisiline dirençli S. aureus) suşlarının önemli bir virulans faktörüdür. Bu suşlar, sağlıklı çocuklar ve genç erişkinlerde nekroz ile seyreden yumuşak doku ve akciğer infeksiyonları oluşturma özelliğindedir. Bu tip infeksiyonlardaki doku nekrozunun PVL salınımının bir sonucu olduğu bildirilmektedir. Bu çalışmada amacımız farklı şehirlerde (İzmir, Ankara, İstanbul) üretilmiş klinik izolatlarda, pvl genine ait 433 bp uzunluktaki, bir bölgeye özgü primerler kullanılarak ilgili genin varlığını araştırmak ve PVL-pozitif bulunan suşların klonal ilişkilerini "pulsed-field gel electrophoresis" (PFGE) tekniği ile değerlendirmektir. Çalışmamızda, luk-PV-1 ve luk-PV-2 primerleri ile S. aureus'a özgü DNAaz genine ait nuc-1 ve nuc-2 primerleri kullanılarak nuc ve pvl genlerini eş zamanlı olarak saptayan bir multipleks PZT yöntemi uygulanmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hastanesi ve İstanbul Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Hastanesi'nden 2005-2007 yıllarında klinik örneklerden izole edilen toplam 299 Staphylococcus aureus suşu (99 MRSA 200 MSSA) bu yöntemle incelenmiştir. Ayrıca PVL üreten izolatların genellikle kısa süreli klonal ilişkilerin ortaya konmasında "altın standart" olarak kabul edilen PFGE yöntemi ile klonal ilişkileri araştırılmıştır. Çalışmaya alınan 299 izolatın 11'i (1 MRSA, 10 MSSA) (% 3.67) PVL-pozitif olarak saptanmıştır. Metisiline heterorezistan izolatların rutin duyarlılık testlerinde saptanmalarında güçlük olabildiği için PVL-pozitif izolatların tümüne aynı zamanda 16S/mec/nuc multipleks PZT uygulanmış ve metisilin direnci değerlendirilmiştir. Bunun sonucunda Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hastanesi'nden MSSA olarak gönderilmiş bir izolatın mec geni taşıdığı yani MRSA olduğu saptanmıştır. MRSA izolatları arasındaki oran % 1 (1/99), MSSA izolatları arasındaki oran % 5 (10/200)‘tir. PVL-pozitif tek MRSA izolatı Hacettepe Üniversitesi Çocuk Hastanesi'nden gelen bir kan örneğinden üretilmiştir. PVL-pozitif MSSA izolatlarının merkezlere göre dağılımıæ Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi hastanesi'nden 6 izolat, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hastanesi'nden 3 izolat, İstanbul Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Hastanesi'nden 1 izolat şeklindedir. Gönderilen MSSA suş sayısına göre oranlaræ Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde % 10 (6/59), Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hastanesi'nde MSSA için % 4.8 (3/62) ve MRSA için % 2.6 (1/38), İstanbul Üniversitesi Çapa Tıp Fakültesi Hastanesi'nde % 1.25 (1/79) olarak belirtilmiştir PVL-pozitif izolatların % 18'i (2/11) kandan (1 MSSA, 1MRSA), % 82'si (9/11) yara kültürlerinden izole edilmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi PVL-pozitif izolatlarının kliniklere göre dağılımı % 50 (3/6)'si Kadın Hastalıkları ve Doğum, % 16.6 (1/6)'sı Kulak Burun Boğaz, % 16.6 (1/6)'sı Beyin Cerrahisi ve % 16.6 (1/6)'sı Plastik Cerrahi servislerindendir PVL-pozitif izolatların PFGE ile klonal ilişkileri incelenmiştir. Dokuz Eylül Üniversitesi izolatlarının dördü birbiri ile ilşkili bulunmuştur. Bu izolatların makrorestriksiyon paternleri ikili gruplar halinde birbirleri ile identiktir. Her iki grup arasında da bir bant fark bulunmaktadır. İdentik izolatlardan ikisi iki aylık bir süre içerisinde farklı servislerden izole edilmiştir. Hacettepe Üniversitesi izolatlarından birinin makrorestriksiyon paterni de bu gruplar ile benzerdir. Diğer izolatlar tamamen farklı suşlar olarak değerlendirilmiştir Sonuç olarakæ özellikle toplum kökenli metisiline dirençli Staphylococcus aureus (CA-MRSA) suşlarının bir göstergesi olan Panton-Valentin lökosidin (PVL)'in, farklı merkezlerden toplanan MSSA ve MRSA izolatlarındaki oranları sırasıyla % 1.3-10 ve % 0-2 olarak bulunmuştur. Bu oranlar yüksek olmamakla birlikteæ klonal olarak birbirleriyle ilişkili izolatların saptanması PVL-pozitif suşların yayılma potansiyelinin bir göstergesi olabilir. Metisilin direncinin rutin yöntemlerle gösterilmesi zor olabileceği için PVL-pozitif izolatlarda mecA genine yönelik moleküler yöntemlerin uygulanması toplum kökenli MRSA suşlarının tanımlanmasında yardımcı olmaktadır. Anahtar Kelimeler: Panton-Valentin Lökosidin (PVL), metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), metisiline duyarlı S. aureus (MSSA), pulsed field gel electrophoresis (PFGE) Staphylococcus aureus, is a pathogen causing many infections varying from skin infections depending on virulence factors to septicaemia. Panton-Valentine Leukocidin (PVL), one of the virulence factors of S. aureus, is a cytotoxin which causes tissue necrosis. Also, PVL is one of the important virulence factors of community acquired MRSA (methicillin resistant S. aureus) strains which appeared recently in several countries. These strains have the feature of forming soft tissue and lung infections accompanying with necrosis in healthy children and young adults. The tissue necrosis in these types of infections is reported as a consequence of PVL release. Our consumption/aim in this study is to investigate the presence of the related gene by using 433 bp long, pvl belonging primers which were obtained in clinical isolates in different countries (Ankara, İstanbul, İzmir) and to evaluate the clonal correlation/relation between the obtained PVL-positive strains with "pulsed-field gel electrophoresis" (PFGE) technique. In our study, a multiplex PCR method was applied, which simultaneously determines nuc and plv genes by using luk-PV-1 and luk-PV-2 primers and S. aureus specific DNAase originated nuc-1 and nuc-2 primers. In total, 299 clinical samples which were collected from Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and İstanbul University Çapa Medical University Medical Faculty in 2005-2007 was examined with this method. Also to reveal the short term clonal correlation of PVL producing isolates, the clonal correlation were investigated with PFGE which is accepted as ‘‘the gold standard'. The 11 of the 299 isolates (1 MRSA, 10 MSSA) (3.67 %) included in the study were determined as PVL-positive. As there was a difficulty in detecting of the routine sensibility of methisiline heteroresistant isolates, 16S/mec/nuc multipleks PCR was applied totally to the PVL-positive isolates at the same time with methisiline resistance investigation. Consequently, it was detected that the isolate suppossed to be MSSA from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital was in fact a MRSA isolate which is carrying mec gene.The rate between the MRSA isolates were detected as 1 % (1/99) and the rate between MSSA isolates were determined as 5 % (10/200). The only PVL-positive MRSA isolate was isolated from a blood sample obtained from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital. According to the centers, the distribution of PVL-positive MSSA isolates were as followsæ 6 isolates from Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, 3 isolates from Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and 1 isolate from Istanbul University Capa Medical University Medical Faculty. The rates according to the number of obtained MSSA strains were determined as 10 % (6/59) in Dokuz Eylül University Medical Faculty Hospital, 4.83 % (3/62) for MSSA and 2.6 % (1/38) for MRSA in Hacettepe University Medical Faculty Child Hospital and 1.25 % (1/79) in İstanbul University Çapa Medical University Medical Faculty. 18 % (2/11) of PVL-positive MSSA isolates were isolated from blood (1 MSSA, 1MRSA) and 82 % (9/11) were isolated from wound cultures. The distribution of the rates of PVL-positive isolates/clinics for Dokuz Eylül University wereæ 50 % (3/6) in Gynaecologics and Obstetrics, 16.6 % (1/6) in Otorhinolaryngology, 16.6 % (1/6) in Brain Surgery and 16.6 % (1/6) Plastic Surgery services. The clonal relation between PVL-positive isolates was investigated with PFGE. It was reported that there was corralation between the four isolates obtained from Dokuz Eylül University. The macrorestriction patterns of these isolates were identical with each other in double groups. Between these two groups a single band pattern difference was found. The two of identic isolates were isolated from different services in two months period. One of the isolates obtained from Hacettepe University have similar macrorestriction pattern with these two groups. Other isolates were evaluated as completely different strains. As a resultæ the Panton-Valentine Leukocidin's (PVL) was an indicator of especially community acquired methisiline resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) strains and MSSA and MRSA isolate rates collected from different centers were found respectively 1.25-10 % and 1.25 % Besides these rates were not highæ the detection of clonal correlation between isolates may indicate the potential of PVL-positive strains extension. As detecting the the methisiline resistance with routine methods might be difficult, applying molecular methods specific to mecA gene in PVL-positive isolates would be helpful for the characterization of the community acquired MRSA strains. Key words: Panton-Valentin Leucocidin (PVL), methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), methicillin sensitive S. aureus (MSSA), multiplex PCR, pulsed field gel electrophoresis (PFGE)