Endometriyal endotel hücrelerinde in vivo BİP ekspresyonu ve BİP'in inflamatuar sitokinler TNF-alfa ve İnterlökin 1 (IL-1) beta tarafından in vitro düzenlenmesi

Abstract

Amaç: Bu tezde insan endometriyal endotel hücre (HEEC) lerinde inflamatuvar sitokinlerin etkisiyle meydana gelen endoplazmik retikulum (ER) stresine bağlı katlanamayan protein cevabın (UPR) düzenlenmesinin incelenmesi hedeflendi. Yöntem: Çalışmada in vivo menstrual siklusun ve erken gebeliğin farklı dönemlerine ait 35 doku örneğinde BİP ile immunohistokimya boyamaları yapıldı. İn vitro olarak ise HEEC izolasyonu ve kültürü yapıldı. Kültürdeki HEECler pasajlandıktan sonra 4 gözlü lamlara ve 96 gözlü mikropleytlere ekildi. 4 gözlü lamlara ekilen HEECler inflamatuvar sitokinlerle 24 ve 48 saat uyarıldı. Deney sonunda fikse edilen HEEClere BİP, fosfo- ve total-eIF-2? immunositokimya ve TUNEL tekniği uygulandı. Doksan altı gözlü mikropleytlere ekilen HEECler ise, 24 ve 48 saat inflamatuvar sitokinler, UPR inhibitörü TUDCA ve UPR uyaranı tunikamisinle uyarılarak MTS ve ELİSA teknikleri ile analiz edildi. Ayrıca inflamatuvar sitokinler ve ovaryan hormonlarla sitimüle edilen HEEClerde BİP ve eIF-2?'nın seviyesi ve eIF-2?'nın fosforilasyon düzeyi Western blot tekniği ile belirlendi. Bulgular: İn vivo endometriyal doku ve erken gebeliğe ait desidual doku endotel hücrelerinde, BİP immunoreaktivitesinin HSCORE değerlendirilmesi ile normal menstrual siklus boyunca geç sekresyon fazında en yüksek; erken gebelikte ve orta sekresyon fazında ise en düşük BİP immunoreaktivitesi saptandı. İn vitro koşullarda tunikamisinle uyarılan HEEClerde kontrole kıyasla, MTS sonucunda ortaya çıkan hücre sayısındaki anlamlı azalmanın, doz bağımlı olduğu izlendi. Ayrıca, IL- ?? 'nın kontrole göre hücre sayısındaki arttırıcı etkisi TUDCA ile birlikte verildiğinde, ortadan kalktı. TUNEL tekniği kullanılarak TNF-? ile uyarılmış HEEClerde kontrole kıyasla daha fazla apoptoza uğramış hücre görüldü. HEEClerin tunikamisin ile doz bağımlı olarak ve TNF-? ile uyarıldığında IL-8 sekresyonunu anlamlı olarak arttırdığı saptandı. Tunikamisinin bu etkisinin, TUDCA ile birlikte uygulandığında anlamlı olarak azaldığı gözlendi. TUDCA, TNF-?'nın da anlamlı etkisini ortadan kaldırdı. Ovaryum steroidleri ile uyarılmış HEEClerde BİP ve eIF-2? protein seviyesi, kontrole göre anlamlı bir farklılık göstermedi, fakat eIF-2?'nın fosforilasyon seviyesi incelendiğinde progesteronun; kontrol, östrojen ve östrojen+progesteron gruplarına kıyasla anlamlı olarak azaltıcı etkisi saptandı. Ayrıca, HEEClerin inflamatuvar sitokinlerle uyarılması sonucunda BİP seviyesinin ve eIF-2? proteininin fosforilasyon seviyesi kontrole göre anlamlı olarak artış gösterdi. Aynı deneyin immunositokimyasal analizleri de bu Western blot sonuçlarımızla paraleldi. Sonuç: Bulgularımıza dayanarak UPR sinyal yolağının insan endometriyumununda endotel hücre proliferasyonun ve apoptozunun moleküler kontrolünde rol aldığını ve bu sürecin menstrual siklus bağımlı olarak kontrol edildiği söylenebilir. Ayrıca bulgularımız inflamatuvar sitokinler TNF-? ve IL-1ß'nın HEEClerde UPR sinyalinin aktivasyonundan sorumlu moleküllerden iki tanesi olabileceğini göstermektedir. Purpose: In this thesis the effects of TNF-? and IL-1ß on unfolding protein response (UPR) related with endoplasmic reticulum (ER) stress in human endometrial endothelial cells (HEECs) was investigated. Materials and Methods: In vivo 28 endometrial tissues from women with different menstrual cycle stages and 7 decidual tissues from early pregnancy were examined for BIP expression using immunohistochemistry. In in vitro: HEECs were treated for 24 and 48 hours with TNF-? and IL-1 ? and evaluated for BIP, total (total-) and phosphorylation (phospho-) eIF-2? expressions by using immunocytochemistry and for apoptosis using TUNEL technique. HEECs also were treated with TUDCA and tunicamycin to analyze for cell proliferation by MTS assay and IL-8 secretion by ELISA. Furthermore, expression of BIP, phospho- and total- eIF-2? in HEECs stimulated by TNF-?, IL-1 ? and sex hormones estrogen and progesterone were also evaluated by Western blot analysis. Results: In vivo: BIP immunostaining was detected at the highest level in HEEC during the late-secretory phase of the menstrual cycle and the lowest in HEEC from the mid-secretory phase and early pregnancy samples. In vitro: Tunicamycin decreased HEECs proliferation compared with control in a dose dependent manner. IL-1ß increased proliferation of HEECs, while TUDCA decreased this proliferative effect of IL-1ß. Furthermore, tunicamycin increased IL-8 secretion in HEECs in a dose-dependent manner which was blunted by TUDCA. Similarly, TNF-? increased IL-8 secretion in HEECs and combination of TUDCA eliminated this effect of TNF-?. TUNEL analysis demonstrated that TNF-? increased the apoptotic cell number in HEECs. Western blot results revealed that BIP protein level was increased by TNF- ? and IL-1 ? while ovarian hormones unchanged the BIP protein level compared with control. Phospho-eIF-2? protein expressions were increased by TNF- ? and IL-1 ? , but decreased by progesterone while estrogen had no effect. According to immunoctyochemical analysis BIP and phospho-eIF-2? expression in cytokine-stimulated HEECs were increased compared to control. Conclusion: Our results suggest that UPR signaling pathway is involved in molecular control of endometrial endothelial cell proliferation and apoptosis, and that process is controlled in a menstrual cycle-dependent manner. Furthermore, our findings reveal that the inflammatory cytokines TNF- ? and IL-1 ? are one of the factors responsible from activation of UPR signaling in HEEC.