Reversible immobilization of catalase by metal chelate affinity interaction on a new generation matrix

Abstract

p(AAm-AGE) kriyojel, akrilamit ve allil glisidil eterin radikalik polimerizasyonu ile hazırlanmıştır. Cibacron Blue F3GA, p(AAm-AGE) kriyojel üzerine reaktif boyanın klor grupları ile allil glisidil eterin epoksit grupları arasındaki reaksiyon sonucu kovalent olarak bağlanmıştır. Cibacron Blue F3GA bağlanan p(AAm-AGE) kriyojel ile Fe(III) iyonları arasında şelat oluşturulmuştur. p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) kriyojel, FTIR, SEM analizleri and şişme derecesinin belirlenmesi ile karakterize edilmiştir. 25,8µmol Fe(III) iyonları içeren IMAC kriyojel, farklı koşullarda (pH, başlangıç protein konsantrasyonu, sıcaklık, akış hızı ve iyonik şiddet) adsorpsiyon çalışmalarında kullanılmıştır. Maksimum adsorpsiyon kapasiteleri p(AAm-AGE)-CB ve p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) kriyojelleri için sırayla 75,7 mg/g ve 60,6 mg/g olarak belirlenmiş ve g kriyojel başına adsorplanan miktar pH 6,0'da 1,5mg/mL derişimde doygunluk değerine ulaşmıştır. Michealis-Menten sabiti ve Vmax değerlerinin p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) kriyojel üzerine katalaz adsorpsiyonuyla belirgin olarak değiştiği belirlenmiştir. Michealis-Menten sabiti serbest katalaz için 0,73 g/L, immoblize katalaz için 0,18 g/L olarak belirlenmiştir. Serbest enzymin Vmax değeri (2000 U/mg enzim) immobilize enziminkinden düşük (2500 U/mg enzim) bulunmuştur. İmmobilize katalazın serbest enzime göre daha geniş sıcaklık aralığında daha yüksek aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca, p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) kriyojel üzerine enzimin defelarca adsorplanıp desorplanabildiği belirlenmiştir. p(AAm-AGE) cryogel was prepared by radical polymerization of acylamide and allyl glycidyl ether. Cibacron Blue F3GA is covalently attached on p(AAm-AGE) cryogel, via the reaction between the chloride groups of the reactive dyes and the epoxide groups of the AGE. Cibacron Blue F3GA attached p(AAm-AGE) cryogel was chelated with Fe(III) ions. p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) cryogel was characterized by FTIR, SEM and swelling degree analysis. The IMAC cryogel carrying 25.8µmol Fe(III) ions was used in adsorption studies under different conditions (i.e., pH, protein initial concentration, flow rate, temperature and ionic strength). Maximum adsorption capacities were found to be 75.7 mg/g for p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) cryogel and 60.6 mg/g for p(AAm-AGE)-CB cryogel, respectively, and the adsorbed amounts per unit mass of cryogel reached to a plateau value at about 1.5mg/mL at pH 6.0. Michealis-Menten constant and Vmax values were significantly affected by adsorption of catalase onto the p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) cyyogel. The Km values were found to be 0.73 g/L for the free catalase and 0.18 g/L for the immobilized catalase. The Vmax value of free catalase (2.0x103 U/mg enzyme) was found to be lower than that of the immobilized catalase (2.5x103 U/mg enzyme). Activity of immobilized catalase was determined higher in a wider temperature range than the free enzyme. It was also observed that enzyme could be repeatedly adsorbed and desorbed on the p(AAm-AGE)-CB-Fe(III) cryogel.