Limbal kök hücrelerin in vitro koşullarda üretilmesi ve karakterizasyonu oküler yüzey kök hücre tanımlanmasında yeni bir boya: "Mitotracker deep red"

Abstract

Günümüzde, limbal ve konjunktival epitelyal kök hücrelerin izole edilmesinde flow sitometrik yöntemlerin kullanılması giderek yaygınlaşmaktadır. Bu flow sitometrik yöntemlerin önde gelenlerinden bir tanesi, DNA'ya bağlanan bir boya olan Hoechst 33342 boyası kullanılarak, kök hücrelerin ayrıştırılmasıdır. Oküler yüzey kök hücreleri, sahip oldukları Adenozin trifosfat kaset bağlayıcı taşıyıcısının G2 alt tipi (ABCG2) sayesinde, bu boyayı hücre dışına atabilmektedirler. Bu hücre dışına atım kapasiteleri kullanılarak, diğer hücrelerden ayrıştırılabilen kök hücreler, literatürde yan popülasyon olarak adlandırılmaktadır. Kök hücrelerdeki ABCG2 taşıyıcısı tarafından, Hoechst 33342 boyasının hücre dışına atılımı sayesinde, bu boyanın hücre içinde birikmesi ve DNA'nın içine girmesi önlenmektedir. Hoechst 33342 boyası ultraviyole lazer (UV) ile uyarılmaktadır. Kök hücrelerin ayrıştırılmasında kullanılan bu yöntemde, Hoechst 33342 ile uzamış inkübasyon ve UV kullanılması gerekmektedir. Bu iki özellik de yöntemin en önemli dezavantajlarından olup, hücrelerde DNA hasarına yol açabilmektedir. Bu çalışmada, oküler yüzey epiteli kök hücre seçilmesinde, bir ABC taşıyıcısı ile taşınan ve 633 nm'de uyarılan "Mitotracker deep red" (MTDR) boyasını, Hoechst 33342 boyasına alternatif yeni bir boya olarak tanımladık. Bu boya, DNA yerine mitokondride birikmekte, uygulaması çok kısa bir inkübasyon süresine ihtiyaç duymakta ve genişletilmiş bir YP seçilmesine olanak sağlamaktadır. Bu boyanın kullanımında, gerek UV lazer ihtiyacının olmaması, gerekse boyanın DNA'da birikmemesi nedeniyle hücrelerde meydana gelebilecek DNA hasarı riski azalmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, öncül hücreler ile ileride yapılacak klinik uygulamalarda, genetik materyal hasarına bağlı oluşabilecek istenmeyen etkilerden korunmada önem taşıyacaktır. In recent years, flow cytometric techniques are used more widely for isolating limbal and conjunctival epithelial stem cells. Hoechst 33342 is one of the dye for this purpose. Limbal and conjunctival epithelial stem cells transport out (efflux) the DNA binding dye Hoechst 33342 by using their G2 subtype Adenosine triphosphate Binding Cassette transporter (ABCG2) and are isolated by flow cytometry as side population (SP) cells. Transport prevents the dye from accumulating in the cell and intercalating with DNA. Unfortunately, SP sorting requires prolonged incubation with Hoechst 33342 and excitation with a UV laser, features that may lead to DNA damage. We have now identified a new ABCG2 substratum, Mitotracker deep red (MTDR) that can be used for SP cell isolation, instead of Hoechst 33342. MTDR is excited at 633 nm, accumulates in the mitochondria, not DNA, it's application requires very short incubation and allows the collection of an expanded SP. These properties will prevent genetic material damage in clinical uses of stem cells in the future. Consistent with the stem cell phenotype, these low Mitotracker deep red dye staining (MTDR low ) cells incorporate a high proportion of cells in the quiescent, G0 state. Clonal studies on feeder 3T3 cells demonstrate that the clonal efficiency of these cells, essential to initiate to growth limbal stem cells for ocular reconstruction is affected by their cell cycle status. Understanding intracellular and extracellular control mechanisms of ocular surface stem cells will potencially improves the usage of these cells for ocular reconstruction.