Mycobacterium tuberculosis suşlarının MIRU-VNTR ve ETR-VNTR yöntemiyle moleküler tiplendirmesi

Abstract

Dünyada Mycobacterium tuberculosis suşlarının epidemiyolojisi ile ilgili yaygın şekilde araştırmalar yapılmasına karşın, ülkemizde bu konuda yeterli veri bulunmamaktadır. Moleküler tiplendirme yöntemleri M. tuberculosis suşlarının epidemiyolojik çalışmalarında önemli yer tutmaktadır. Birçok moleküler tiplendirme yöntemi bulunmasına karşılık son yıllarda yapılan çalışmaların sonuçlarına göre Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (MIRU) - Variable Number Tandem Repeats (VNTR) yöntemiæ ayrım gücü ile tekrarlanabilirliği yüksek, uygulaması kolay, çok merkezli çalışmalara uygun ve otomatize edilebilir bir yöntemdir. MIRU-VNTR yönteminin tüberkülozla ilişkili moleküler epidemiyolojik çalışmalarda kullanımı giderek artmakta, yakın gelecekte diğer yöntemlerin yerine geçeceği düşünülmektedir. Ülkemizdeki diğer moleküler yöntemlerde olduğu gibi MIRU-VNTR profilleri konusunda da yeterli veri bulunmamaktadır. Bu çalışmada, bölgemizden soyutlanan 152 M. tuberculosis izolatının MIRU-VNTR yanısıra ETR-VNTR yönteminin de kullanılarak tiplendirilmesi amaçlanmış ve ETR gen bölgesi primerlerinin çalışmaya eklenmesinin, sadece MIRU gen bölgesi primerleri kullanılarak ortaya çıkan ayrım gücüne etkisi araştırıldı. QBASIC 4.5 programlama diliyle bu çalışma için hazırlanmış bir bilgisayar programı yardımıyla 152 MIRU-VNTR ve ETR-VNTR sonucu retrospektif olarak analiz edildi. Bu program aracılığıyla, 12 MIRU ve 3 ETR gen bölgesinin her primerinin ve primer kombinasyonlarının ayrım gücü yanı sıra oluşan küme sayıları ve tek izolatlar belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre primer setleri tek başlarına değerlendirildiklerinde en yüksek ayrım gücü MIRU 26 primeriyle saptanırken, en düşük ayrım MIRU 39 primeriyle elde edildi. 12 MIRU gen bölgesi primerine 3 ETR gen bölgesi primeri eklendiğinde ortaya çıkan küme sayısının 111 den 122 ye çıktığını ve ETR gen bölgesi primerlerinin ayrıma önemli katkı sağladığı görülmektedir. 12 MIRU gen bölgesi primerlerinin kullanımıyla ek olarak 3 ETR gen bölgesi primerlerinin kullanımı yani 15 primerin toplu kullanımı karşılaştırıldığındaæ ilk dört sırada tercih edilen primerlerde (MIRU 26, MIRU 40, MIRU 16 ve MIRU 10) değişiklik olmadığı saptandı (Tablo 4-5). Fakat gerekli ayrımı sağlamak için kullanılması gereken 5. primer olan MIRU 23'ün yerini ETR-A gen bölgesinin aldığı belirlendi. Bir tiplendirme yönteminin ayrımı güçlü bir şekilde yapmasının yanında hızlı sonuç vermesi ve ekonomik olması da önemlidir. M. tuberculosis'in moleküler olarak tiplendirilmesi gerektiğinde ve epidemiyolojik çalışmalarda yöntemin daha hızlı sonuç vermesi ve ekonomik olması için MIRU ve ETR gen bölgeleri primerlerinin kademeli bir şekilde kullanılması gerektiği sonucuna varıldı. Anahtar Sözcükler: Mycobacterium tuberculosis, moleküler tiplendirme, MIRU-VNTR, ETR-VNTR In spite of global epidemiological investigations on Mycobacterium tuberculosis isolates, there is insufficient data related to our country. Molecular typing methods play a key role in epidemiological studies. Although many methods were used for molecular typing, recent researches show that Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit (MIRU)-Variable Number Tandem Repeats (VNTR) method has a high discriminatory power and reproducibility, is easy to perform, and available for multi-centric studies and automation. As is the case in the other molecular typing methods, there is insufficient data for MIRU-VNTR profile related to our country. The aim of this study was molecular typing of 152 clinical isolates which were isolated from our region, by ETR-VNTR in addition to MIRU-VNTR. The addition of ETR loci primers to MIRU loci primers allowed us to assess its effect on discriminatory power when compared to using MIRU alone. A retrospective analysis of 152 MIRU-VNTR and ETR-VNTR data was performed by a computer based program which was prepared by using QBASIC 4,5 programming language. By this program, individual and combined discriminatory powers of 15 different primers (12 MIRU and 3 ETR loci) were calculated, the clusters were differentiated and unique isolates were identified. According to the results of this study, MIRU loci 26 has the highest and MIRU loci 39 has the lowest discriminatory power. Our results indicate that the addition of these 3 ETR loci, increases the clusters 111 to 122, and discriminatory power obtained with the 12 MIRU loci. First four primers (MIRU 26, MIRU 40, MIRU 16 ve MIRU 10) which have the highest discriminatory power, remained unchanged when compared 12 MIRU with 12 MIRU and 3 ETR (Table 4-5). However, it was determined that ETR-A loci took the fifth highest place instead of MIRU 23. Beside discriminatory power, rapidity and cost-effectivity of a typing method is also considerable. As a conclusion, to get more rapid and economic epidemiological investigations and molecular typing of M. tuberculosis in case of necessity, MIRU and ETR loci primers have to be performed progressively. Key Words: Mycobacterium tuberculosis, molecular typing, MIRU-VNTR, ETR-VNTR