Pilositik astrositomlarda doku mikroarray yöntemi ile nöral kök hücre immunofenotipik kompozisyonunun ve nüks yönünden riskli grupların araştırılması

Abstract

Amaç ve hipotez: Günümüzde birincil beyin tümörlerinin kök hücrelerden kaynaklandıgı hipotezi güçlenmektedir. Çalısmamızda nöral kök hücre belirleyicilerinin pilositik astrositomlardaki ekspresyonunu ve sonuçların prognostik açıdan degerini arastırmak amaçlanmıstır. Kök hücre belirleyicilerinden CD133, CD34, p75NTR, Sox-2 antikorları pilositik astrositom olgularına immunohistokimyasal yöntemle uygulanmıs, ekspresyonlar glial belirleyicilerin (olig-2, GFAP, vimentin) ve nöronal belirleyicilerin (Nörofilamen, Neu- N, sinaptofizin) ekspresyonları ile karsılastırmalı olarak incelenmistir. Bu tümörlerde ayrıca EGFR, p53, bcl-2, Ki-67 gibi tümör iliskili antijenler arastırılmıstır. Moleküler degisiklikler yanısıra olguların klinik özellikleri de tümörün biyolojik davranısını aydınlatmak için incelenmistir. Yöntem: 1990-2005 yılları arasında tanı alan 62 pilositik astrositom olgusundan doku mikroarray blok ve kesitleri hazırlanmıstır. Otopsi vakalarına ait fetal ve eriskin normal serebral korteks, serebellum dokuları kontrol amaçlı kullanılmıstır. Kesitlere immunohistokimyasal yöntemle CD133, CD34, p75NTR, bcl-2, EGFR, Nörofilamen, GFAP, vimentin, sinaptofizin, Sox-2, Olig-2, p53, Ki-67, NeuN antikorları uygulanmıs, floresan in situ hibridizasyon yöntemi ile de 15 olguda 1p/19q delesyonu incelenmistir. Bulgular: Olguların yas ortanca degeri 84 aydır (aralık 14-193 ay). Kız/erkek oranı esittir. Olguların %68'i (n=42) arka çukur, %29'u (n=18) supratentoryal bölge, %3'ü (n=2) medulla spinalis yerlesimlidir. 32 olguya (%52) total, 30 olguya (%48) subtotal eksizyon uygulanmıstır. Olguların %15'inde (n=9) ortalama 12 ay içerisinde nüks saptanmıstır. Vimentin tüm olgularda, GFAP ise fokal boyanma gösteren dört olgu (%10) dısında yaygın eksprese edilmistir. Sinaptofizin immunoreaktivitesi 40 olgunun 25'inde (%62), Nörofilamen 57 olgunun %21'inde (n=12), NeuN 50 olgunun %4'ünde (n=2) pozitiftir. EGFR ve p53 pozitifligi olguların hiçbirinde izlenmemistir. Bcl-2 antikoru ile 39 olgunun %16'sında (n=6) ekspresyon saptanmıstır. Ki-67 41 olguda ortalama %2 (aralık %0-8) oranında pozitiftir. CD133 bir olgu dısında olguların hiçbirinde, CD34, p75NTR de hiçbir olguda pozitif saptanmamıstır. Sox-2, 48 olguda ortalama %45 (aralık %0-90) oranında, Olig-2 ise 50 olguda ortalama %35 (aralık %0-90) oranında pozitiftir. _x0005_statistiksel inceleme sonucunda nüks gelisimi cerrahi eksizyon derecesi ve yas ile ters yönde, Ki-67 boyanma indeksi ile pozitif yönde iliskili bulunmustur. Yası 5'ten küçük olguların hem tüm olgular hem de sadece subtotal eksizyon uygulanan olgular arasında nükssüz sagkalım süreleri daha kısadır. Ki-67 boyanma indeksi %2'den yüksek olgularda nükssüz sagkalım süreleri daha kısadır. _x0005_mmunohistokimyasal belirleyiciler ile nüks gelisimi arasında istatistiksel olarak anlamlı iliski saptanmamıstır. Floresan in situ hibridizasyon yöntemi uygulanan 15 olguda 1p/19q delesyonu saptanmamıstır. Sonuç: Pilositik astrositom olgularında glial belirleyiciler yanı sıra daha düsük oranlarda olsa da nöronal belirleyicilerin eksprese edilmesi tanısal yaklasım için önemlidir. Özgül olmayan bir nöral kök hücre belirleyicisi Sox-2'nin pilositik astrositomlarda varlıgı kök hücre hipotezini desteklemektedir. Olig-2'de izlenen immunoreaktivite sonuçları, GFAP ve vimentin sonuçları ile birlikte pilositik astrositomlardaki glial diferansiasyonu göstermekte, 1p/19q delesyonunun saptanmaması oligodendroglial diferansiasyon olasılıgından uzaklastırmaktadır. Subtotal eksizyon uygulanan, 5 yas altında tanı alan ve Ki-67 boyanma indeksi %2'den yüksek olgular nüks yönünden riskli gruplardır. Bazı kök hücrelerde ve nadiren yüksek dereceli glial tümörlerinde izlenebilen CD133, p75NTR antijenleri pilositik astrositomlarda gözlenmemistir. Yüksek dereceli glial tümörlerde görülen p53 mutasyonu, EGFR amplifikasyonu pilositik astrositomlarda nüks gelisimi ile iliskili degildir. Çalısmada kullanılan doku mikroarray yöntemi genis immunohistokimyasal panel ve in situ hibridizasyon incelemesini kolaylastırmıstır. Anahtar kelimeler: Pilositik astrositom, nöral kök hücre, nüks, doku mikroarray yöntemi Aim and hypothesis: There is growing evidence for the role of stem cells in some primary central nervous system tumors. In order to determine the presence and the prognostic significance of stem cell markers in pilocytic astrocytoma, we have analyzed the expression of a set of antibodies including CD133, CD34, p75NTR, Sox-2, in a large series of pilocytic astrocytomas. In addition, we have analyzed the expression of glial (olig-2, GFAP, vimentin) and neuronal (neurofilament, synaptophysin, and NeuN)) markers to determine a relationship between the above groups of markers. We have also analyzed some of the tumor-associated antigens, such as EGFR, p53, bcl-2, and Ki-67 in this group of tumors. The results were then correlated with clinical findings in order to determine an association between the marker status of tumors and their clinical characteristics in order to determine biologically important factors. Method: The tissue microarray blocks and slides were prepared from 62 pilocytic astrocytoma cases. Fetal and adult normal cerebral and cerebellar brain sections from autopsy cases were used as controls. All microarrays were stained with antibodies against CD133, CD34, p75NTR, bcl-2, EGFR, Neurofilament, GFAP, vimentin, synaptophysin, Sox-2, Olig- 2, p53, Ki-67 and NeuN using standard immunohistochemical techniques. Fifteen random cases were also analyzed for 1p/19q deletion by flourescent in situ hybridization. Results: There were 62 patients with a median age of 84 months (range 14-193 months). Femal/male ratio was equal. The tumor localizations were as follows: posterior fossa, 68% (n=42)æ supratentorial, 29% (n=18)æ spinal cord, 3% (n=2). Gross total resection was performed in 32 cases (52%) and the remainder of the cases underwent subtotal resection. There were nine recurrences (15%) with a mean recurrence free period of 12 months. All cases strongly expressed vimentin and GFAP was diffusely positive in all but four cases in which the staining was focal. There was synaptophysin positivity in 25, neurofilament positivity in 12 and NeuN positivity in two cases. No tumor was positive for EGFR, p53, p75NTR and CD34 protein. Bcl-2 was found positive in six cases (16%). The mean Ki-67 labeling index for all tumors was 2% (range 0-8%). CD133 was detected in only one case. The mean percentage of Sox-2 positive cells was 45% (range 0-90%) and Olig-2 positive cells was 35% (range 0-90%). There were no deletions on 1p/19q analysis by flourescent in situ hybridization. In univariate/bivariate analysis, recurrence negatively correlated with extent of surgical resection and age at initial diagnosis, positively correlated with Ki-67 labeling index. Patients younger than 5 years of age had shorter recurrence free period even among patients with subtotal resection. Tumors with a Ki-67 labeling index higher than 2% also had a shorter recurrence free period. There was no statistically significant correlation between the expression of immunohistochemical markers and recurrence free survival. Conclusion: The positive staining with neuronal markers highlight the challenges often experienced in practical surgical pathology in the diagnosis of pilocytic astrocytomas. While we believe most such staining were either due to incorporated normal brain tissue, immunopositivity of neuronal markers in pilocytic astrocytomas requires further scrutiny. The presence of a non-specific stem cell markeræ sox-2 in pilocytic astrocytoma also suggests that some tumor cells may have stem-cell like properties, or may have been derived from sox-2 positive stem cells. Olig-2 positivity along with GFAP and vimentin simply implies a strong glial differentiation, and absence of a so-called oligodendroglial differentiation, especially in tumors that resemble oligodendroglioma, is further supported by the absence of 1p/19q deletion. p53, EGFR, p75NTR, CD133 antigens don't seem to have a role in the biological behaviour of pilocytic astrocytomas. Subtotal or incomplete surgical resection still seems to be a major risk for recurrence, so are age less than 5 years at diagnosis and Ki67 labeling index greater than 2%. Other immunohistochemical markers tested in this study were not associated with recurrence-free or overall survival. Tissue microarray method provided benefits in this studyæ enabled the use of a large immunohistochemical panel and in situ hybridization, and can be recommended for similar studies. Key words: Pilocytic astrocytoma, neural stem cell, recurrence, tissue microarray method