Formalin ve ksilol yerine kullanılan solüsyonların doku takibine etkisi

Abstract

Amaç: Formalin ve ksilolün önemli toksik, allerjen ve karsinojen etkileri vardır. Günümüzde, bu kimyasalların yerine geçebilecek daha az toksik maddeler piyasaya sürülmüştür. Bu maddelerin, histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamalara; in situ hibridizasyon, polimeraz zincir reaksiyonu gibi incelemelere olumsuz etki etmemesi beklenir. Çalışmamızda, Türkiye'de ticari olarak satılan alternatif kimyasalların etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.  Gereç ve Yöntem: 5 farklı fiksatif (Formalin, Glyo-Fixx, FineFIX, Cell block ve Greenfix) ve 4 farklı şeffaflandırıcı (Ksilen, Sub-X, Bio Clear, Shandon Xylene Substitute) kullanılarak 13 farklı doku takibi kurgulanıp, 13 farklı dokuya uygulandı. Hematoksilen-Eozin boyalı kesitler histomorfolojik düzeyde niteliksel olarak karşılaştırıldı. Hazırlanan doku mikrodizini kesitlerine histokimyasal ve immünohistokimyasal boyamalar uygulandı. Histokimyasal boyamalar niteliksel, immünohistokimyasal boyamalar ise bilgisayar programında (3D Histech NuclearQuant, MembraneQuant) niceliksel olarak karşılaştırıldı. Kromojenik in situ hibridizasyon uygulandı ve sinyal kalitesi değerlendirildi. DNA ve RNA ekstraksiyonu uygulanarak ve DNA niteliği polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirilerek doku takipleri moleküler düzeyde kıyaslandı. Bulgular: Tüm doku takiplerinde kesit kalitesinin iyi olduğu gözlendi. Histokimyasal boyama sonuçları, alternatif solüsyonların tümünün bu uygulamalar açısından uyumlu olduğunu gösterdi. İmmünohistokimyasal boyamalarda etken maddesi glyoxal olan fiksatiflerle olumsuz sonuçlar elde edildi. Kromojenik in situ hibridizasyon ile tüm doku örneklerinde sinyalin okunaklığı, zeminin kontrastı benzer ve iyi özellikte bulundu. Ayrıca formalin içermeyen takiplerin moleküler korunma açısından, formalin içerenlere göre üstün olduğu görüldü. Sonuç: Tüm parametreler birlikte değerlendirildiğinde, Glyo-Fixx, Cell block ve FineFIX kullanılan doku takiplerinin, biraz daha üstün oldukları dikkati çekmektedir. Daha az toksik, daha az irritan olmaları, iyi morfolojik sonuç vermeleri, histokimyasal boyamalar ile uyumlu olmaları ve moleküler koruma açısından formaline üstün olmaları nedeni ile alternatif fiksatifler, rutin patoloji ve araştırmalarda formalinin yerini almaya adaydır. Alternatif fiksatif arayışının geri planda bıraktığı alternatif şeffaflandırıcıların da ksilenin yerini almaya güçlü adaylar olduğu görülmüştür. Aim: Formaldehyde and xylene are main solutions of tissue processing. But these chemical substances have important toxic, allergen and carcinogenic effects on human body. Nowadays, nontoxic or lesser toxic new commercial solutions have been produced to be used in place of formaldehyde and xylene. It is expected to be compatible with histochemical and immunohistochemical stainings, also with in situ hibridisation and polymerase chain reaction from these new alternative solutions. In this study, we aimed to assess the impact of new alternative solutions on methods mentioned above.  Methods: Thirteen different tissue processings were designed and performed on 13 different tissues by using five different fixatives (Formaldehyde, Glyo-Fixx, FineFIX, Cell block ve Greenfix) and four different clearing agents (Xylene, Sub-X, Bio Clear, Shandon Xylene Substitute). Haematoxylin&Eosine stained sections were compaired by using qualitative histomorfological criterions. Histochemical and immunohistochemical stains were performed by using tissue microarrays. Histochemical staining results were compaired by using qualitative criterions while immunohistochemical staining results were compaired with quantitative datas which were had by using a computer programme (3D Histech NuclearQuant, MembraneQuant). Tissue sections were tested for the availability of chromogenic in situ hibridisation, by using a Her-2/neu protocol. Also different tissue processings were compaired at molecular level by performing DNA and RNA extraction, and DNA quality by polymerase chain reaction. Results: The quality of sections was well for all tissue processings. Histochemical staining results showed that all alternative solutions which were used are suitable for this application. Immunohistochemical staining results showed that alternative solutions which contain glyoxal as active agent need optimization fort his application. The clearance of signals with chromogenic in situ hibridisation were nearly same and well for all tissue samples. Furthermore, tissue processes which do not contain formaldehyde were found to be superior compaired with ones which contain formalin as fixative solution on molecular preservation. Conclusion: We have demonstrated that formaldehyde-free fixatives have potential in routine pathology and research to replace formaldehyde in histomorphology and protein preservation. When all parameters were evaluated together it was found that the tissue processes which contain Glyo-Fixx, Cell block and FineFIX as fixative solution were superior compared the others. We have also demonstrated that alternative clearing agents which stayed behind the scenes because of the search of ideal fixative have the potantial in routine pathology to replace xylene.