Metil parationun testiste oluşturduğu toksik hasara likopenin koruyucu etkisinin biyokimyasal, ışık mikroskobik ve ultrastrüktürel düzeyde incelenmesi

Abstract

Çalışmamızda organofosfatlı bir insektisit olan Metil paration (MP)'un oluşturmuş olduğu hasara karşı yüksek kapasitede antioksidan etkiye sahip bir karotenoid olan Likopen (LKP)'in koruyucu etkisi, ışık mikroskobik, immunuhistokimyasal, biyokimyasal ve ultrastrüktürel parametreler doğrultusunda araştırılmıştır. Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Etik Kurulu'nun 72/2008 protokol no'lu 08.08.2008 gün ve 90 sayılı kararı ile çalışmaya başlanmıştır. Çalışma gruplarımızæ I. grupæ Kontrol grubu: Ab libutum beslenen hiçbir madde uygulanmamış bazal değerler için kullanılan deney grubu (n=7, 28 gün) II. grupæ Sham grubu: MP eklenmemiş 0,5 ml mısır yağı verilen grup (n=7, 28 gün oral gavaj (og.) III. grupæ LKP grubu: (4 mg/kg/gün) LKP 0,5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek verilen grup (n=7, 28 gün og.) IV. MP deney grubu: 0,28mg/kg/gün (1/50 LD50) MP 0.5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek verilen grup (n=7, 28 gün og.) V. grupæ MP+LKP deney grubu: 0,28mg/kg/gün MP 0,5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek (4 mg/kg/gün) LKP ile birlikte verilen grup (n=7, 28 gün og.) olmak üzere 5 gruba ayrıldı. Bütün gruplardaki deneklerin sağ testisleri MDA, GPx, SOD ve elektronmikroskop (EM) ölçümleri için ayrıldı. MDA, SOD, GPx ölçümleri için ayrılan dokular spektrofotometrik yöntemle incelendi. EM için ayrılan dokular transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile ince yapı düzeyindeki değişiklikleri incelendi. Sol testis ışık mikroskobik incelemeler için ayrıldı. Histolojik takipten sonra TUNEL yöntemi uygulanarak DNA fragmantasyonu değerlendirildi ve aktif kaspaz-3 immunohistokimyasal (IHC) boyama yapılarak TUNEL değerlendirmeleri desteklendi. Hematoksilen-eozin (H&E) ile boyanarak histolojik değerlendirme ve morfometrik ölçümler yapıldı. Testiste yapılan histolojik ve morfometrik değerlendirmeye göre, MP grubunun kontrol, sham ve LKP gruplarına göre hasarlı olduğu ve MP+LKP grubunda LKP'nin bu hasarı önlediği gözlendi. DNA hasarının değerlendirilmesinde kontrol, sham, LKP ve MP+LKP grupları arasında spermatogoniyum ve spermatositlerde TUNEL pozitif boyanan hücrelerde anlamlı fark gözlenmezken, MP grubunda spermatogoniyum ve spermatositlerde TUNEL pozitif boyanan hücreler kontrol, sham ve LKP gruplarına göre anlamlı derecede yüksek bulundu. MP ve MP+LKP grupları karşılaştırıldığında MP+LKP grubunda TUNEL pozitif boyanan hücrelerin sayısında MP grubuna göre anlamlı derecede azalma gözlendi. TUNEL sonuçlarını desteklemek amacı ile yaptığımız aktif kaspaz immunohistokimyasal (IHC) değerlendirmelerine göreæ kontrol, sham, LKP ve MP+LKP grupları arasında spermatogoniyum ve spermatositlerde aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücrelerde anlamlı fark gözlenmezken, MP grubunda spermatogoniyum ve spermatositlerde aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücreler kontrol, sham ve LKP gruplarına göre anlamlı derecede yüksek bulundu. MP ve MP+LKP grupları karşılaştırıldığında MP+LKP grubunda aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücrelerin sayısında MP grubuna göre anlamlı derecede azalma gözlendi. Gruplar arası MDA, SOD ve GPx değerleri kıyaslandığında MP grubunda kontrol, sham ve LKP grublarına oranla MDA düzeyinin artığı ve GPX düzeyinin anlamlı derecede azaldığı gözlenirken SOD değerleri istatistiksel olararak anlamlı olmayan bir azalma göstermiştir. MP gurubu MP+LKP grubu ile karşılaştırıldığında MDA düzeyinin anlamlı derecede arttığı GPx düzeylerinin anlamlı derecede azaldığı, SOD değerlerinde ise anlamlı olmayan bir artış gözlenmiştir. Ayrıca deneklerin deney başında ve deney sonundaki vücut ağırlıkları ölçülerek değerlendirmeye alınmıştır. Elde ettiğimiz bulgular doğrultusunda düşük doz MP 'un testiste oluşturduğu toksik hasara 4mg/kg LKP'nin koruyucu etkisi olduğu fakat hasarı tamamen engellemediğini gördük. Anahtar kelime: Metil paration, testis, organofosfat, likopen, apopitoz, ultrastrüktürel In our study, we examined the protective effects of Lycopene, which has a high capacity of antioxidant effect on Methyl parathion (MP) caused testis damage with light microscopic, immunohistochemical, biochemical and electron microscopic parameters. Study started with the decision of Dokuz Eylül Medical Sciences Institude Ethics Commission dated on 21.11.2008 with number 129 and protocol 72/2008. Animals were divided into 5 groups. I.groupæ Control: animals used for basal parameters and fed ad libitum for 28 days. (n=7). II. groupæ Sham: 0,5 ml corn oil lack of MP applied for 28 days by oral gavage. (n=7). III. groupæ Lycopene group: (4mg/kg/day) LKP dissolved in 0,5 ml corn oil was applied to animals for 28 days by oral gavageæ IV group MP group: 0,28mg/kg (1/50 LD50 mg/kg/day) MP dissolved in 0,5 ml corn oil was applied to animals for 28 days by oral gavage. (n=7). V.groupæ 1/50 LD50 (0,28 mg/kg/day) MP+LKP group: 0,28 mg/kg MP dissolved in 0,5 ml corn oil was applied to animals with 4 mg/kg/day LKP for 28 days by intragastric sonda. Right testises of all animals were collected for MDA, GPx, SOD and EM assessments. MDA, SOD and GPx levels were studied with spectrofotometric techniques. Tissues collected for EM were studied with Transmission Electron Microscopy for assessment of fine structures. Left testises were collected for light microscopic evaluations. After histological routine procedures, DNA fragmentations were evaluated with TUNEL assay. Active caspase- 3 IHC staining was performed to support TUNEL assay results. Histological evaluations and morfometric measurements were performed on H&E stained sections. According to histological and morfometric evaluationsæ MP group was found more damaged than control, sham and LKP groups. According to MP+LKP group's results, LKP found protective against damage significantly. According to DNA fragmentation assayæ no significant differences were observed between control, sham, LKP and MP+LKP groups. But in MP groupæ TUNEL positive spermatogonium and spermatocyte numbers were significantly higher than control, sham and LKP groups. TUNEL positive cell numbers of MP group was more than MP+LKP group. According to active caspase -3 IHC staining assayæ no significant differences were observed between control, sham, LKP and MP+LKP groups. But in MP groupæ Active caspase-3 IHC positive spermatogonium and spermatocyte numbers were significantly higher than control, sham and LKP groups. Active caspase -3 IHC positive cell numbers of MP group was more than MP+LKP group. According to MDA, SOD and GPx levelsæ MDA levels of MP group was found higher and GPx levels found lower than control, sham and LKP groups significantly. SOD levels were lower with no statistical significancy. MDA levels increased and GPx levels were decreased significantly and SOD levels were decreased with no statistical significancy in MP group as compared with MP+LKP group. In addition, body weights of rats were recorded before and after the experimental process. According to our study, we observed that 4mg/kg LKP has an important protective effect on toxicological damage of testis caused by low dose of MP application. Nevertheless, LKP cannot completely prevent toxicological injury that MP caused. Key words: Methyl parathion, testis, organophosphote, lycopene, apopitosis, ultrastructural